1گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین- پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، پیشوا، ایران
2گروه بیوشیمی و بیوفیزیک، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین-پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، پیشوا، ایران
3گروه علوم زیستی و بیوتکنولوژی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران
تاریخ دریافت: 13 آذر 1397،
تاریخ پذیرش: 13 آذر 1397
چکیده
کلستریدیوم دیفیسیل (Clostridium difficile)، باکتری گرم مثبت، بیهوازی و اسپوردار بوده که به عنوان فاکتور شایع اسهال بیمارستانی شناخته شده و عامل گاستروآنتریت وکولیت با غشاءکاذب است. هنگامی که میکروفلور طبیعی روده، توسط فاکتورهای خطر، مانند درمان با آنتیبیوتیکها، شیمیدرمانی و غیره آشفته میشود، کلستریدیوم دیفیسیل فرصت تکثیر یافته و باعث بیماری میشود. عوامل اصلی بیماریزایی این باکتری، دو توکسین B وA هستند،که توسط ژنهایTcdA و TcdB کد میشوند. تظاهرات بالینی عفونت کلستریدیوم دیفسیل دامنه ای از کلنی سازی بدون علامت، اسهال شدید، کولیت غشایی، مگاکولون سمی و مرگ است. هدف از این تحقیق جداسازی باکتری های کلستریدیوم دیفیسیل از نمونه های مدفوع و توسعه روش qPCR به منظور شناسایی عفونت کلستریدیومدیفیسیل از طریق طراحی پرایمرهای اختصاصی برای ژنهای TcdA و TcdB میباشد. در این مطالعه ابتدا 100 نمونه بالینی طی 6 ماه از بیماران تحت درمان در مرکز پزشکی و درمانی آیت الله طالقانی جمع آوری شد. همچنین یک سویه استاندارد از بانک میکروبی انستیتو پاستور تهیه شد. با بررسی دقیق نواحی حفاظتشده در توالی ژنهای TcdA و TcdB، دو جفت پرایمر برای تکثیر اختصاصی نواحی مورد نظر طراحیشد. سپس بهینهسازی روش qPCR با استفاده از این پرایمرها انجامشد. حساسیت روش با استفاده از غلظتهای مختلف DNA باکتری مورد ارزیابی قرارگرفت. علاوه براین، به منظور بررسی اختصاصیت روش از DNA باکتریهای مولد اسهال (اشرشیاکلی، شیگلا دیسانتری، سالمونلا تیفی و یرسینا انتروگلیتیکا) استفاده شد. در نهایت عملکرد روش بهینهسازیشده با تعداد 100 نمونه بالینی مورد ارزیابی قرارگرفت. حساسیت روش به میزان pg100از DNA و اختصاصیت روش بهینهسازی شده 100% تعیین شد. در نمونههای بالینی مورد مطالعه با روش بهینهسازی شده 9 مورد مثبت شناسایی شد. با توجه به نتایج بدست آمده استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژنهای TcdA و TcdB میتواند به عنوان رویکرد مناسبی برای شناسایی سریع و دقیق عفونت C. difficile در تکنیک qPCR مورد استفاده قرارگیرد.