استفاده از تکنیک qPCR به منظور شناسایی سویه‌های کدکننده توکسین Clostridium difficile

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین- پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، پیشوا، ایران

2 گروه بیوشیمی و بیوفیزیک، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین-پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، پیشوا، ایران

3 گروه علوم زیستی و بیوتکنولوژی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران

چکیده

کلستریدیوم ­دیفیسیل (Clostridium difficile)، باکتری گرم ­مثبت، بی­هوازی و اسپوردار بوده که به عنوان فاکتور شایع اسهال بیمارستانی شناخته شده و عامل گاستروآنتریت وکولیت با غشاءکاذب است. هنگامی که میکروفلور طبیعی روده، توسط فاکتورهای خطر، مانند درمان با آنتی­بیوتیک­ها، شیمی­­درمانی و غیره آشفته می­شود، کلستریدیوم دیفیسیل فرصت تکثیر یافته و باعث بیماری می­شود. عوامل اصلی بیماری­زایی این باکتری، دو توکسین B وA هستند،که توسط ژن­هایTcdA و TcdB  کد می­شوند. تظاهرات بالینی عفونت کلستریدیوم دیفسیل دامنه ای از کلنی سازی بدون علامت، اسهال شدید، کولیت غشایی، مگاکولون سمی و مرگ است. هدف از این تحقیق جداسازی باکتری های کلستریدیوم دیفیسیل از نمونه های مدفوع و توسعه روش qPCR به منظور شناسایی عفونت کلستریدیوم­دیفیسیل از طریق طراحی پرایمرهای اختصاصی برای ژن­های TcdA و TcdB می­باشد. در این مطالعه ابتدا 100 نمونه بالینی طی 6 ماه از بیماران تحت درمان در مرکز پزشکی و درمانی آیت الله طالقانی جمع آوری شد. همچنین یک سویه استاندارد از بانک میکروبی انستیتو پاستور تهیه شد. با بررسی دقیق نواحی حفاظت­شده در توالی ژن­های TcdA و TcdB، دو جفت پرایمر برای تکثیر اختصاصی نواحی مورد نظر طراحی­شد. سپس بهینه­سازی روش qPCR با استفاده از این پرایمرها انجام­شد. حساسیت روش با استفاده از غلظت­های مختلف DNA باکتری مورد ارزیابی قرارگرفت. علاوه براین، به منظور بررسی اختصاصیت روش از DNA باکتری­های مولد اسهال (اشرشیاکلی، شیگلا دیسانتری، سالمونلا تیفی و یرسینا انتروگلیتیکا) استفاده شد. در نهایت عملکرد روش بهینه­سازی­شده با تعداد 100 نمونه بالینی مورد ارزیابی قرارگرفت. حساسیت روش به میزان pg100از DNA و اختصاصیت روش بهینه­سازی شده 100% تعیین شد. در نمونه­های بالینی مورد مطالعه با روش بهینه­سازی شده 9 مورد مثبت شناسایی شد. با توجه به نتایج بدست آمده استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژن­های TcdA و TcdB می­تواند به عنوان رویکرد مناسبی برای شناسایی سریع و دقیق عفونت C. difficile در تکنیک qPCR مورد استفاده قرارگیرد.

کلیدواژه‌ها